人参皂苷Rh2抑制人脑胶质瘤细胞SHG44生长及机制研究

www.binso.cn 2017-05-25 来源:并搜
人参皂苷Rh2抑制人脑胶质瘤细胞SHG44生长及机制研究神经胶质瘤是来源于神经外胚层的颅内常见恶性 肿瘤 ,复发率高,生存期短。开展神经胶质瘤

人参皂苷Rh2抑制人脑胶质瘤细胞SHG44生长及机制研究

神经胶质瘤是来源于神经外胚层的颅内常见恶性 肿瘤 ,复发率高,生存期短。开展神经胶质瘤综合治疗,加强基础研究是神经外科学等多学科的重大课题。本实验发现人参皂苷Rh2(简称Rh2)能显著抑制人脑胶质瘤细胞SHG44(简称SHG44)的生长。实验结果为Rh2作为新药应用提供了有价值的资料。

材料与方法

1. 材料:Rh2(本院陈燕萍教授惠赠),SHG44购于上海细胞研究所。细胞增殖核抗原(PCNA)-SABC免疫试剂盒(武汉博士德公司)。PCNA-DNA引物设计如下:PCNA上游引物,CYGCAGAGCATGGACTCGTC,下游引物CCGTTGAAGAGAGTGGAGTG,β-actin上游引物,AAGAGAGGCATCCTCACCCT,下游引物,TACATGGCTGGGGTGTTGAA.顺序为5’-3’。

2. 方法:

  (1)细胞生长曲线:SHG44常规培养对数生长期细胞成1.25*105密度,接种于24孔板、24h后更换培养液,分别加入浓度为0、4、8、16、32μmol/L的Rh2,此日为第0天。分别于第1、2、3、4、5天,每组消化3复孔细胞,台盼蓝染色判定细胞活性后,光镜下计数。第三天更换培养液,并维持Rh2浓度。

(2)MTT实验:消化对数生长期的SHG44,支撑2*105细胞/ml细胞悬液,接种于96孔平板,没空2*104细胞悬液100μl,同时分别加入上述终浓度100μlRh2。培养72h,采用MTT法检测各组细胞的抑制率。试验中发现16μmol/L的Rh2效果最好,在电镜和流式细胞仪及PCNA的组织化学和PCNA的RT-PCR转录研究中主要采用16μmol/L及一下浓度。

  (3)流式细胞检测细胞凋亡及细胞周期变化:消化SHG44,以5*105接种25cm2培养瓶,24h后更换培养液,分别加入终浓度为0、8、16μmol/L的Rh2,此日被称为第0天。在第3天分别收集各组细胞,检测各组的凋亡率和细胞周期变化。

  (4)电镜检测:细胞传代培养,分别加入Rh2终浓度为0、8、16μmol/L。3d后更换一次培养液(含Rh2),培养5d,导致镜拍片后,消化并收集细胞,用Epon812包埋,切片,随机拍摄电镜照片,观察超微结构。

  (5)免疫组织化学方法(ABC法)检测PCNA蛋白表达情况:12孔板内,实验组加入细胞悬液100μl,16μmol/LRh2200μl,DMEM1.7ml,对照组加入无Rh2的对照液200μl,培养3d,常规免疫组话,ABC法染色。结果判定,光镜检查,PCNA蛋白阳性表达为细胞核呈棕黄色,用目镜网格测微尺人选10个视野(4*),每视野观察100个细胞,记阳性细胞数,结果以平均值±标准差表示,t检验。

(6)聚合酶链反应监测PCNA转录产物含量:接种SHG44细胞5*105/25cm2培养瓶分别加入Rh2,终浓度为8和16μmol/L。第三天用Tripue等时机提取总RNA,精确定量。PCR反应管加入1μloligodT1μl总RNA液体,置于PCR仪中,80℃10min,冰水浴5min,没管中加入1μlRNA酶抑制剂,2μldNTP,1μl逆转录酶,4μl5*buffer,补水至20μl。置于PCR仪中42℃反应2h;95℃加热5min,-20℃保存备用。PCR反应体系:①10*buffer5μl;②dNTP2μl;③PCNA上游及下游引物各2μl;④β-action上游及下游引物各2μl;⑤cDNA模板1μl;⑥TagE(热稳定性DNA聚合酶),补水至50μl。PCR 程序:95℃35秒,60℃1min,72℃1min,30个循环。结果检测:取20μlPCR反应物,1.5%琼脂糖凝胶电泳;Kodak凝胶电泳成像分析系统(EDAS)分析,计算对照组与实验组PCNA/β-action的比值。

结果

1. 细胞增殖的变化:Rh2对SHG44有生长抑制作用,并呈现浓度时间依赖性。8、16、32μmol/LRh2作用3d后细胞增殖受抑制,P<0.05;作用5d后,P<0.01。以上实验组与对照组细胞存活比率>90%.

2. MTT检测结果:4-32μmol/L的Rh2均有抑制作用,32μmol/L时细胞抑制率接近90%。

  3. 流式细胞仪检测结果:Rh2可以诱导SHG44凋亡,于G0/G1可见凋亡峰,Rh28、16μmol/L组凋亡比率有明显提高。给药组细胞碎片明显提高。

4. 细胞超微结构改变:2个剂量组Rh2作用5d后,电镜下可见细胞呈现凋亡形态学改变,胞体变小,变圆;核内染色质离散,想核膜下集中;细胞表面微绒毛辨析,细胞体及细胞核进一步缩小,核内染色质呈颗粒状或块状凝集于核膜下,内质网和线粒体膜碎裂呈空泡状;微绒毛脱落,减少,核膜在核膜孔处断裂,将染色质分割成若干个核碎片;胞质内空泡增多。对照组细胞体积大胞质少,核内染色质分布均匀;细胞表面有大量的微绒毛。

  5. PCNA蛋白表达情况:Rh216μmol/L给药5d后PCNA-LI(PCNA-标记指数)(22±5.21)明显低于对照组(55±7.68)。

6. PCNA转录产物含量的变化:PCNA基因与β-catin的RT-PCR产物长度分别为558bp和211bp。对照组和2个给药组的PCNA/β-actin密度平均比值分别为1.2、0.8和0.9.

讨论

Rh2是红参中发现的皂苷类物质。分子式为C36O8H62分子量622.88,学名22(S)-Proto-panaxadiol-3-O-Β-d-glucopyanoside,分子量小,脂溶性强,已通过血脑屏障。Rh2能通过逆转耐药等多种途径抗 肿瘤 。SHG44是人脑胶质瘤细胞,比啮齿类胶质瘤细胞株更接近临床,因此研究价值更高。

实验表明浓度为4μmol/L的Rh2能够抑制SHG44的增值,32μmol/L几乎使SHG44增值停止,抑制率达90%。研究表明,诱导分化剂作用机制是减少进入细胞分裂周期的细胞数,并使细胞阻滞于某一时相,不能完成DNA复制,同时细胞凋亡率明显增高。细胞一旦通过G-S限制点(restrictionpoint),便不再受其他因素的调控而进入S期完成DNA的复制,所以作用于G-S限制点的药物可以组织细胞进入分裂周期。本实验充分证明Rh2对SHG44有诱导凋亡作用:显著降低G2–M期和S期细胞的比例,呈现G1期细胞阻滞,给药组的凋亡率较对照组有统计学意义。大量细胞阻滞于G0-G1期,增殖受限。

增殖细胞核抗原(PNCA)是一种仅在增殖细胞中合成与表达的36KD的酸性蛋白,人类PCNA基因全长约7.0kb,位于第20号染色体。细胞内PCNA含量反映了细胞增殖周期有关,G1期表达逐渐增加,S期达到高峰G2/M期减少。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,为DNA复制合成必不可少的因子。本实验既检测PCNA的蛋白表达水平。Rh2处理后5d的SHG44中PCNA蛋白的表达与转录产物较对照组有明显下降。通过RT-PCR法检测PCNA的蛋白表达水平也检测了转录产物表达水平。Rh2处理后5d的SHG44中PCNA蛋白的表达与转录产物较对照组有明显下降。通过RT-PCR法检测PCNA的转录产物情况,在药物对肿瘤细胞抑制机制研究文献中还未见报道。Rh2是小分子脂溶性物质,可能很容易通过肿瘤细胞的质膜进入细胞核,通过某种机制抑制了PCNA基因的转录或减少了转录产物。Rh2不尽在体外有抑制SHG44增殖作用,体内也能抑制大鼠闹内移植的SHG44增殖作用,体内也能抑制大鼠脑内移植的SHG44实体瘤的生长。

综上所述,Rh2抑制SHG44细胞增殖机制与抑制SHG44的PCNA基因蛋白表达,减少基因转录产物,诱导细胞凋亡有关。Rh2可能成为治疗胶质瘤的新药。

参考文献

1 张纪深入开展胶质瘤综合治疗及其基础研究。中华神经外科杂志,2003,19:1-2。

2 FeiXF,ZhengKY,WangBX,etal,GinsenosideRh2showingabilitytoinduceapoptosisinhelacells。ChemresChinese,2003.

3 姜浩,樊光华,人参皂苷Rh2对人肝痛Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响。中国肿瘤临床与康复,2004,11:289-292。

4 杨玉琪李玛琳。人参皂苷的抗肿瘤作用及其机制,药学进展,2003,27,287-290.

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